6月9-10日，“2018年第七届生物育种暨高通量筛选技术理论与应用研讨会暨中国生物发酵产业协会微生物育种分会第四次学术会议”在四川成都盛大开幕。本次会议由中国生物发酵产业协会、四川省微生物学会、农业部沼气科学研究所、四川大学与清华大学联合主办，清华大学无锡应用技术研究院生物育种研究中心、无锡源清天木生物科技有限公司、洛阳华清天木生物科技有限公司联合承办。本次大会吸引来自全国百余所高等科研院所专家、学者及企业技术负责人共计近300人参会。

大会现场

李旭峰教授致辞

清华大学邢新会教授致辞

石维忱理事长致辞

　　大会由清华大学邢新会教授主持，邢教授介绍了此次大会的相关情况，代表组委会给予各界的大力支持表示衷心的感谢。四川大学校党委副书记李旭峰、中国生物发酵产业协会石维忱理事长代表主办单位作了精彩致辞。在大会上作报告的部分嘉宾及内容摘要：

　　郑裕国院士，浙江工业大学生物工程学院教授。报告题目《工业生物催化剂的筛选与应用》。内容摘要：工业生物催化剂的筛选、发现与改良是工业生物技术创新的源头，同时也是制约其大规模应用的瓶颈。传统的菌种筛选技术通常依赖色谱技术，处理量小、效率低、筛选周期长。如何开发高通量、高灵敏度的工业生物催化剂筛选方法是实现工业生物技术发展面临的巨大挑战。课题组长期从事生物催化剂的筛选、发现和应用研究。基于酶催化反应特性，建立了脂肪酶、羰基还原酶、腈水解酶、腈水合酶、酰胺酶、卤醇脱卤酶、羟化酶和转氨酶等系列重要工业生物催化剂的高通量筛选技术。获得了大量适应工业应用环境的新型、高效生物催化剂，开发成功多个大品种药物生物催化合成新技术，取得了显著的经济、社会效益。

　　陈宁，天津科技大学教授：报告题目：氨基酸生产菌株选育策略与发展趋势。内容摘要：首先对氨基酸产业现状进行概述。然后结合课题组多年研究成果，系统介绍了氨基酸生产菌株选育技术，包括传统育种、常规代谢工程育种、系统代谢工程育种和精确调控代谢工程育种技术。利用ARTP诱变技术和高通量筛选，获得了一株高产尿苷的枯草芽孢杆菌。常规代谢工程育种策略可以概括为“进、通、节、堵、出”五字策略。系统代谢工程基于途径分析、组学分析和进化策略。在代谢工程育种中，高效的基因组编辑技术不可或缺。最近，又开发出以CRISPR/dCas9介导的基因调控技术，包括基因弱化和基因强化表达。应用这些手段产生了精确调控代谢工程育种技术。利用基因整合表达和精确调控代谢工程，我们开发出四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶高产菌株。最后介绍了氨基酸菌株选育的发展新方向。

　　张翀，清华大学副教授。报告题目：微生物基因型－表型高通量关联技术与装备。内容摘要：尽管在许多化学品绿色合成路线替代方面取得了重要进展，微生物制造仍面临诸多挑战：菌种研发周期长、大多数品种生产效率（转化率、时空产率）仍然很低，无法满足未来制造业“按需定制”、“高效柔性”的发展需求。下一代基因测序和核酸合成等高通量技术，结合合成生物学标准化、模块化的策略为高效快速构建丰富多样的微生物基因型（甚至人工合成基因组）创造了重要机遇，然而表型（功能）才是实现微生物应用核心问题，如何从海量的基因型中高效、快速获取表型及其关联信息仍然面临巨大挑战。本报告将介绍近年来我们在微生物基因型－表型高通量关联平台技术与装备方面的进展，包括基于液滴微流控和小分子生物传感的微生物工业表型高通量连续进化技术；全基因组CRISPR干扰库筛选、核酸序列深度突变扫描等微生物基因型功能深度挖掘技术；以及我们在上述技术系统化、设备化方面的尝试。

　　杨广宇，上海交通大学研究员。报告题目：基于单细胞超高通量筛选的酶基因快速定向进化。内容摘要：应用合成生物学构建高效的人工生物催化体系需要具有理想功能的酶，定向进化是人工优化和塑造酶功能的重要途径，但其效率受限于对突变库进行高通量筛选。近年来，我们使用直径仅有几微米的微液滴作为微型酶反应器，发展了基于荧光激活微液滴分选（Fluorescence-activateddropletsorting，FADS)的超高通量筛选系统，可以在流式细胞仪或微流控芯片上以极高的速度对酶活性进行定量分析与筛选。针对FADS对荧光底物的特殊要求，我们提出了荧光液滴捕获（Fluorescence droplet entrapment，FDE）底物设计原则，并针对一系列重要工业酶合成了FADS专用荧光探针。近期，我们建立了首个可直接对酶底物选择性、立体选择性等复杂性质进行筛选的双通道微流控液滴分选系统(Dual-channelmicrofluidic droplet screening,DMDS)，该系统将液滴检测和筛选部件集成在一块微流控芯片上，能够以1300个克隆/秒的高速度同时对两种荧光信号进行检测。利用DMDS系统，我们对布洛芬酯酶进行了5轮定向进化，从近500万个随机突变体中筛选获得了立体选择性提高700倍的突变酶，展示了这一体系在酶功能优化方面的能力。目前我们正在通过设计新的荧光底物、构建多酶级联荧光检测系统等手段，进一步扩展FADS筛选体系的应用范围，以期它在酶工程、代谢工程、合成生物学等领域发挥更大作用。

　　彭方，武汉大学副教授。报告题目：质谱在微生物鉴定及高通量筛选中的应用。内容摘要：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry , MALDI-TOF MS）是21世纪发展起来的一种新型软电离质谱技术，对生物大分子进行识别和结构分析的方法。作为一种新兴的蛋白质组学技术，现已广泛应用于生命科学及相关领域，也是一项新兴的微生物鉴定技术，与传统鉴定方法相比MALDI-TOF MS具有操作简便快速，高通量、低成本、准确等特点。通过微生物质谱数据库的建立，MALDI-TOF MS能准确鉴定大部分细菌和真菌，特别是对一些相似度高、检测过程复杂的菌株进行快速、精确的鉴定。另外，利用对MALDI-TOF质谱图谱的聚类和比较分析，可以对微生物的不同菌株或不同功能活性的菌株进行高通量筛选和质量控制。

　　李晚忱，四川农业大学玉米研究所教授。报告题目：常压室温等离子体诱导玉米矮秆突变。内容摘要：常压室温等离子体是集多种诱变因素的第四态射流，可改变细胞壁和细胞膜结构和通透性，诱发DNA突变。在多种微生物诱变育种上应用，培育出生产效能更高的工业菌株。我们用改进的植物诱变等离子体发生器处理玉米萌动种子，获得显性突变矮秆株系。DNA重测序表明，按基因组全部碱基对计算，突变率0.083%，高于化学诱变突变率。虽然已有数十个玉米矮秆突变体及相关基因的报道，但大多属隐性单基因突变或表现畸形，一些数量性状位点致矮力不强，在杂交种组配中很难利用。少数数量性状位对株高的降低程度适中，对产量等农艺性状无明显不良影响，但仅有少数成功克隆和功能验证报道。为发掘更多矮秆基因型，解析矮化机理，扩增玉米株型育种种质，本项目拟结合运用常规遗传育种与现代分子生物学技术，在验证等离子体对植物诱变效果的同时，鉴定矮秆突变株系的致矮力、配合力及综合农艺性状表现，评价矮秆突变株系在玉米杂交种选育中的利用潜势。

　　侯吉伦，中国水产科学研究院北戴河中心实验站副研究员。报告题目：基于ARTP的牙鲆种质资源创新研究。

　　彭卫红，四川省农业科学院研究员。报告题目：名贵珍稀食用菌羊肚菌的驯化栽培及产业化开发。内容摘要：对课题组承担的名贵珍稀食用菌羊肚菌的驯化、配套关键技术研究及产业化开发的现状、问题和趋势等进行回顾和总结。

　　高程海，广西中医药大学研究员。报告题目：基于ARTP方法筛选具有抑制甘蔗鞭黑粉菌活性的海绵共生细菌突变株研究。内容摘要：甘蔗是一种一年生或多年生热带和亚热带草本植物。中国是世界第3大甘蔗生产大国，2016年甘蔗种植面积152.7万公顷，甘蔗产量约11382.5万吨。对甘蔗年产量制约最大的生物因素为甘蔗鞭黑粉菌引起的甘蔗黑穗病，其已成为世界上最棘手和具有毁灭性的甘蔗病害。由于品种单一、旱地种植和宿根蔗占比大，以及对蔗种消毒和蔗田病害防治不够重视，造成中国甘蔗黑穗病发生率逐年增加。依据发病程度不同，甘蔗黑穗病一般引起甘蔗产量损失10%-30%，发病严重的甚至可达到50%-70%，给中国蔗糖生产带来巨大的安全隐患。利用常压室温等离子体（ARTP）诱变育种仪，在诱变条件：功率120W，间距2mm，气量10SLM，处理时间175s下诱变B.siamensis，后经筛选得到一株稳定高产化合物A的突变菌A72，其活性成分产量为38.0496 µg/mL，比原始菌株增加52.8%。利用蛋白组学的方法分析化合物A处理后菌体中蛋白变化，以1.3倍为变化阈值，t-test p-value<0.05为标准，发现差异蛋白533个，后经分析GO、KEGG通路分析，从中筛选出目的蛋白8个，结合蛋白功能初步推测化合物A主要通过影响氧化磷酸化代谢过程来达到抑制效果。

　　苏海佳，北京化工大学教授。内容题目：绿色生物制造-复杂原料多细胞体系的人工构建。内容摘要：针对工业含糖废水、农业废水、餐厨垃圾等复杂底物体系，以微生物营养调控与代谢机理为关键科学问题，通过构建人工多细胞体系，从细胞、代谢、基因及转录水平对其协同作用进行深入剖析，揭示多菌群在复杂底物体系中生长代谢过程中物质、调控和信息传递规律，阐明复杂底物体系高效转化/利用与多细胞体系协同效应机制。

　　堵国成，江南大学教授。内容题目：新一代工业生物技术中的高通量筛选技术与应用。内容摘要：报告概述了新一代发酵工程技术的研究进展，介绍了高通量筛选平台技术发展情况、应用领域和高通量培养条件优化平台的特点，重点介绍了高通量筛选在工业生物技术中的成功应用实例，并对高通量筛选技术应用进行了展望。

　　易犁，湖北大学教授。报告题目：分子改造促进蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中的异源分泌表达。内容摘要：蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中的异源分泌表达能有效简化蛋白分离提取步骤，从而降低蛋白的工业生产成本。近来，我们通过开发新型分泌引导蛋白，以及对分泌引导蛋白前段信号肽和细胞壁构成进行分子改造有效提高了木聚糖酶、精氨酸酶、单链抗体等蛋白在大肠杆菌中的分泌表达；并通过辅助因子的共表达有效提升了人源溶菌酶在毕赤酵母中的分泌表达。

　　其中，通过在冰核蛋白氨基端添加多聚谷氨酸或多聚赖氨酸，从而能够有效增加其融合表达精氨酸酶的胞外分泌量。而运用一种超折叠GFP（sfGFP）作为新的融合蛋白标签，也能够促进内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶H（Endo H）、精氨酸酶I（ARG1）、谷氨酸脱羧酶（GAD）、抗菌肽PG4等蛋白和多肽在大肠杆菌中的分泌表达，使它们的分泌表达量分别达到了0.471 g/L、0.397 g/L、0.198 g/L、0.121 g/L。此外，通过敲除类脂A合成相关基因LpxM，利用Sec途径分泌信号肽使木聚糖酶在大肠杆菌中的简单分泌成为可能，其胞外蛋白分泌浓度达到了0.12 g/L，活性达到3415 U/mL。同时，我们也对酵母细胞中内质网和高尔基体介导的蛋白分泌途径进行深层次解析，并采用辅助因子协同表达等策略有效促进了溶菌酶等高经济价值蛋白在毕赤酵母中的分泌表达。例如，利用基因剂量效应和辅助因子Pdi1，使人源溶菌酶在毕赤酵母中的分泌表达量达到了0.24 mg/mL，其针对溶壁微球菌的活性高达14120 U/mL。

　　邓禹，江南大学教授。内容题目：大肠杆菌中高产己二酸代谢途径的重建。内容摘要：己二酸是一种重要的二元羧酸，当前最重要的应用领域是合成尼龙类纤维（比如尼龙6,6）。预计到2018年，己二酸全球的市场价值将达到63亿美元，产量约25.6亿公斤。工业上己二酸的生产路线主要是硝酸氧化法，但其工艺流程长，副产物较多，污染严重。因此人们迫切需要寻找一种绿色，环保合成己二酸的方法。在微生物中直接生产己二酸的途径是不存在的，人们开始合成己二酸的前体顺，顺-粘康酸，但顺，顺-粘康酸到己二酸需要金属铂等化学催化剂催化，因此限制了发展。进而人们开始探索己二酸的全生物合成途径，美国的Genomatica公司和Verdezyne公司是该研究领域的领跑者，但是却没有透露己二酸的具体产量和产率。以往的研究均是从不同的底物间接合成己二酸，产量、产率低。而本研究是以之前在Thermobifidafusca中发现的3-氧代己二酰辅酶A途径为基础，通过密码子优化6种己二酸合成过程中所需酶的基因，然后将构建好的质粒导入BL21（DE3）中进行表达，经气相色谱质谱联用仪及核磁鉴定为己二酸。出发菌株Mad136可产0.3g/L己二酸（转化率为13.9%），并经确定5-Carboxy-2-pentenoyl-coa还原酶（Tfu_1647）为逆降解途径的关键酶。随后使用pTrc99a过量表达Tfu_1647基因，最终形成Mad146菌株，可产生4.3g/L己二酸，转化率为55.5%。为了进一步的提高产量，本实验利用CRISPR/Cas9消除途径的主要次级代谢产物以减少碳通量竞争和敲除琥珀酸辅酶A合成酶基因以促进琥珀酰辅酶A的积累，从而增加己二酸合成的前体，最终形成菌株Mad123146。此菌株可利用甘油发酵可产生68.0g/L己二酸，比初始菌株提高了225倍，为报道的最高值。